混凝土生物破坏与海底隧道微生物群落，和应对的科技进展

文 |黛月白

编辑 | 黛月白

引言

近年来，海底隧道建设成为了现代交通发展的重要组成部分，随着时间的推移，一些海底隧道的钢筋喷射混凝土遭受了恶化现象，这引起了研究人员的关注，更加令人惊讶的是，研究发现这些恶化的混凝土内，蕴藏着各种不同的微生物群落。

混凝土生物破坏

混凝土的生物破坏，是由微生物的代谢活动引起的，包括细菌、古菌、真菌和藻类，它导致了混凝土结构和功能的不良变化，开裂、剥落、凹坑和混凝土基质中化合物的溶出，微生物需要在混凝土表面定居并形成生物膜，这个过程被称为生物污垢。

生物膜提供了多种优势，易于获取营养物质，并对极端环境和侵蚀性化合物具有抵抗力。

在混凝土表面形成的生物膜中，微生物细胞，被嵌入在自产生的胞外聚合物物质中，生物膜具有高度水化和开放的结构，其中不同微生物群落的菌落之间有空隙，形成微环境的梯度。

混凝土表面的高粗糙度、孔隙和微裂纹，为生物污垢的形成提供了有利条件，混凝土的pH值在施工后通常较高，对微生物的定居具有一定的免疫性，但当pH值降低到一定程度时，生物污垢才会形成，释放出的生物酸进一步降低了混凝土的pH值，最终溶解水泥糊浆基质。

仅靠生物酸无法完全解释混凝土的全面破坏，更多是由于持续进行的微生物相互作用的影响，降低的pH值还促进了钢筋和纤维的腐蚀，生物膜中的胞外聚合物，进一步加速了钢筋的腐蚀，其中含有负电荷，促进与金属的离子和静电结合，产生了电偶反应。

微生物的活动导致了混凝土的持续破坏，混凝土的生物破坏是一个复杂的过程，不仅涉及生物酸的作用，还包括微生物相互作用和钢筋腐蚀多个因素，海底隧道等重要建筑物，科研人员需要采取适当的防护措施，以延缓混凝土的生物破坏过程，确保结构的安全和可持续发展。

奥斯陆峡湾海底隧道的微生物群落

研究人员在挪威德罗巴克附近的奥斯陆峡湾海底隧道，进行了采样，这个隧道长7,306米，宽11.5米，最大深度为海平面以下134米，岩体主要由花岗片麻岩和伟晶岩组成，其中的节理和断层带含有黏土矿物质。

采样是在三个不同的隧道位置进行的，主隧道、泵站和奥斯陆峡湾试验场地，代表两种不同的混凝土基材。主隧道和泵站的混凝土喷涂于1999年，用作永久岩体支护。这些混凝土采用了一种快速硬化水泥，水胶比为0.42。

胶凝剂含量约为514 kg/m^3，添加了5%硅灰，并添加了钢纤维增强和减水剂。根据混凝土标准NS EN 206，这些混凝土属于耐久性等级M45和强度等级B45。硫酸铝被用作凝结促进剂。

奥斯陆峡湾试验场上的混凝土耐久性试验始于2010年3月，不久后就发现了微生物生物膜，试验场的混凝土基于CEM II/AV 42,5 R，采用不同的配比制备，生物膜采样站点位于水胶比为0.43、4%硅灰、减水剂。

钢纤维和聚丙烯纤维制成的喷涂混凝土上，同样使用硫酸铝作为凝结促进剂，这种混凝土与其他两个位置的混凝土相比，对应于M45和B45，使用飞灰水泥制成的混凝土，被认为比基于CEM I的混凝土更耐久。

在评估水泥糊剂降解和钢纤维腐蚀的风险时，使用了NS EN 206的暴露等级，在所有三个研究地点和所有混凝土配比中，所使用的等级为XC2-XC3、XS3和XA3，这些混凝土在这样的环境中，被认为是耐久的。

需要注意的是，混凝土的标准环境分类，并未考虑生物膜的影响在泵站中，水的温度为13°C，在主隧道和测试点的位置大约为8-9°C，并且在过去几年中保持相对稳定，尽管科研人员没有测量与生物膜相关的水流量，但在所有位置上的主要特征是水的渗透速度较慢。

需要注意的是，从2013年开始，泵站的水负荷在空间和容量上都持续增加，与此相比，之前的13-14年期间，生物膜主要是由较小区域中的缓慢渗透水所形成，这段文字描述了对生物膜样品和水样品，进行微生物群落分析，以及化学分析的方法。

采集的生物膜样品是厚且软的，使用金属管取得样品核心，而薄生物膜则用手术刀从混凝土上刮下，采样后，样品立即在乙醇-干冰混合物中快速冷冻，并在运输过程中放置在干冰中，并在-80°C下保存，直到进行核酸提取。

一部分生物膜样品还用于化学分析，水样品则在无菌瓶中收集，并在运输到实验室期间放置在干冰中，所有水样品在分析前均经过0.45微米的过滤，用于化学分析的生物膜样品在分析前经过均质化，并在105°C下干燥。

微波消解后，使用电感耦合等离子体质谱仪以及酸按照EPA 3051协议对选择性金属进行定量分析，生物膜的总固体和挥发性固体，分别根据APHA 1998标准方法2490 A-D进行分析，水中的氯化物、硝酸盐、铵盐和硫酸盐则根据FINAS认可的方法进行分析。

这个工作流程的目标是从生物膜样本中提取DNA，并进行PCR扩增和测序，最后进行数据分析，科研人员使用Fast DNA spin kit for soil从500mg的生物膜中提取DNA，这个试剂盒可以高效地提取DNA，并且适用于土壤样本。

科研人员使用引物515′F和806 R进行PCR扩增16S rRNA基因的V4区域，这一区域可以涵盖细菌和古菌的序列，以便进行宏基因组分析，这些引物在先前的研究中已经被验证为有效。

PCR扩增后，科研人员对产物进行纯化和归一化处理，以准备测序，科研人员使用Illumina MiSeq和MiSeq试剂盒v2进行测序，Illumina MiSeq是一种高通量测序平台，可以产生大量高质量的DNA序列数据。

测序完成后，科研人员使用USEARCH v.10进行序列处理和筛选，科研人员使用MiDAS筛选数据库对序列进行分类，这样可以将不同的序列与已知的分类进行对比，以确定它们属于哪些细菌或古菌。

科研人员对分类的序列变异体，在这个研究中，科研人员使用了三个R包来进行多元统计学、多样性和空模型计算，以及数据可视化，科研人员使用配对Sorensen和Bray-Curtis差异，来估计样本间的β多样性，并使用主坐标分析将样本可视化。

科研人员使用置换多元方差分析，来检验样本间β多样性的差异，在vegan包中，科研人员使用标准化效应大小，来估计配对Sorensen差异，以测试样本间随机组成，科研人员使用保持物种丰富度和物种发生率的空模型，并使用quasiswap算法进行999次模拟的空模型群落。

科研人员使用picante包来计算未加权最近分类指数，并使用“taxa.labels”的空模型，进行999次迭代，以测试密切相关类群之间的系统发生聚类，为了探索微生物群落结构与生物膜，以及水的化学特性之间的关联。

科研人员使用Welch's ANOVA，来检验群落丰富度和均匀度的差异，并使用Games-Howell检验进行事后分析，这些分析有助于科研人员理解样本间的差异和相似性，并从中推断出关于微生物群落结构及其与环境特征之间的关系。

本实验使用微传感器，对生物膜进行原位氧和pH梯度测量，氧微传感器和pH微传感器与参比电极结合使用，连接到一个多用途仪表上，并通过软件进行控制，在每次测量之前，先使用一个已使用过的微传感器估计生物膜的深度。

将微传感器尖端定位在生物膜-水界面上，并在每次测量之前等待一段时间进行微剖面测量，实验过程中，根据制造商的协议，氧传感器进行了校准，使用100％空气饱和盐水地下水在当前温度下进行校准，而pH传感器使用当前温度下的三个pH缓冲液点进行线性校准。

扫描电子显微镜，是一种科学仪器，用于观察微小的样品，在这个实验中，科研人员使用了一台名为Hitachi S-4800SEM的仪器，配备了能量散射X射线光谱仪，科研人员将未经涂层的手选样品固定在碳胶带上，并使用这台仪器，对样品进行了化学点分析。

对于大多数元素，分析精度在1-2%之间，但对于碳和氮元素，精度相对较低，科研人员还捕捉了样品的反射电子图像，以提供更多的信息，科研人员使用了扫描电子显微镜和能量散射X射线光谱仪，来对未经处理的样品进行化学分析。

这些实验帮助科研人员了解样品的化学成分，并提供了有关样品结构和特性的详细信息，测量结果表示，奥斯陆峡湾海底隧道的盐水地下水，与海水的化学成分相似，它们的主要成分是氯化物、钠和硫酸盐，浓度较高。

而铵离子、硝酸盐和溶解有机碳的浓度较低，科研人员研究了接触混凝土和生物膜后的水样，与仅接触岩体的水样相比，科研人员发现钙、镁和钒的浓度更高，对于其他元素，没有明显的差异。

通过对生物膜的化学分析，科研人员发现橙色生物膜中，含有较高浓度的铁和钙，而黑色生物膜中含有较高浓度的锰，科研人员还通过失重，测定确定了生物膜中有机物的含量，结果显示大部分生物膜成分是无机物。

根据16S rRNA SVs的分类分析，科研人员发现变形菌门是生物膜群落的主要成员，占据了群落的44-49%，除了变形菌门，大部分SVs属于隐球菌门、古菌门、拟杆菌门和放线菌门，微酸菌门和硝化螺旋菌门，在64个生物膜样本中的相对序列丰度，超过了总群落的2%。

为了更直观地了解这些结果，科研人员绘制了一个箱线图，展示了生物膜中前15个主要门的情况，阅读量采用对数刻度显示，在箱线图中，粗体垂直线代表中位数，箱体边界代表25%和75%分位数，排除异常值的水平线代表最小值和最大值，而点表示异常值。

这些分析结果表明不同的菌门在生物膜群落中，扮演着重要的角色，并且变形菌门是最主要的成员之一，微酸菌门和硝化螺旋菌门，在样本中的相对序列丰度也相对较高，这些信息有助于科研人员更好地了解生物膜的组成，和生态系统中不同微生物的相对丰度。

海底隧道钢筋喷射混凝土中，蕴藏的微生物群落，对于海底隧道的生物破坏，具有重要意义，通过深入研究和了解这些微生物群落，科研人员可以更好地应对，和解决海底隧道钢筋喷射混凝土的恶化问题，保障隧道的结构完整性和使用安全性。

结语

通过深入研究和了解微生物的特性和作用机制，科研人员可以制定合理有效的预防和控制策略，保障隧道的结构完整性和使用安全性，这需要工程界、学术界和政府部门的共同努力与支持，才能在海底隧道建设和维护中取得更大的成功。

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